Nowe strategie w terapii raka trzustki – rola MSC i kombinacji leków

Czy MSC to klucz do przełamania oporności na leczenie raka trzustki?

Rak trzustki pozostaje jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów, z prognozami wskazującymi, że może stać się drugą wiodącą przyczyną zgonów z powodu chorób nowotworowych. Diagnoza zwykle następuje w zaawansowanym stadium, co skutkuje niekorzystnym rokowaniem i niskim wskaźnikiem przeżycia 5-letniego, wynoszącym zaledwie 2-9%. Chociaż resekcja chirurgiczna jest preferowaną metodą leczenia, często jest niemożliwa ze względu na zaawansowanie choroby. Chemioterapia skojarzona, w tym FOLFIRINOX oraz gemcytabina z nab-paklitakselem, stanowi podstawę leczenia systemowego, jednak skuteczność tych terapii pozostaje ograniczona.

Naukowcy nieustannie poszukują nowych strategii terapeutycznych, które mogłyby przełamać bariery w leczeniu raka trzustki. Jednym z obiecujących kierunków jest wykorzystanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) jako nośników leków przeciwnowotworowych. MSC wykazują unikalne właściwości, takie jak niska immunogenność, silne działanie immunomodulacyjne oraz tropizm do miejsc zapalnych, co czyni je idealnymi kandydatami do dostarczania substancji leczniczych bezpośrednio do guza i przerzutów.

Badania wykazały, że MSC mogą pobierać cząsteczki gemcytabiny (GEM) z otoczenia za pomocą transporterów nukleozydów i skutecznie je uwalniać, hamując wzrost komórek raka trzustki. Co więcej, terapeutyczny efekt MSC wynika również z wydzielania szerokiej gamy czynników wzrostu, cytokin i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, które przyczyniają się do regeneracji tkanek oraz łagodzenia reakcji zapalnych i immunologicznych.

Stosowanie MSC jako nośników leków napotyka jednak pewne ograniczenia, przede wszystkim ze względu na nieefektywną transfekcję. Ponadto MSC, jako żywe komórki, mogą wpływać na mikrośrodowisko guza poprzez promowanie proliferacji komórek nowotworowych, migracji i oporności na leki. Te efekty, wraz ze zdolnością absorpcji leków, różnią się w zależności od pochodzenia MSC i warunków hodowli, co podkreśla znaczenie uwzględnienia ich heterogeniczności. Pomimo tych obaw, MSC są nadal uważane za obiecujące w zastosowaniach klinicznych, jednak ich produkcja musi być zgodna z Dobrą Praktyką Wytwarzania (GMP), aby zachować właściwości immunomodulacyjne.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) wydzielane przez MSC zawierają bioaktywne cząsteczki takie jak RNA, DNA, białka i lipidy, i są zaangażowane w komunikację międzykomórkową, homeostazę tkanek i regulację immunologiczną. Egzosomy pochodzące z MSC wykazały znaczący potencjał terapeutyczny w naprawie kości poprzez promowanie różnicowania osteogennego, angiogenezy i modulowanie odpowiedzi immunologicznych. MSC mają tendencję do lokalizowania się w skupiskach nowotworowych, gdzie ich egzosomy wywierają efekty biologiczne w zależności od ich ładunku molekularnego. Ładunek może być wprowadzany do egzosomów biernie (np. inkubacja z lekiem) lub aktywnie (np. transfekcja, sonikacja), każda z określonymi zaletami i wadami.

Gemcytabina (GEM) jest antymetabolitem pirymidynowym, który wbudowuje się w podwójną helisę DNA, zakłócając jego syntezę i prowadząc do śmierci komórki. Jest to lek specyficzny dla fazy S cyklu komórkowego. Jako związek cytotoksyczny, GEM powoduje uszkodzenie i/lub śmierć komórek, jednak jest szybko metabolizowany i wydalany z organizmu. Aby zwiększyć skuteczność leczenia, pacjentom zaleca się przyjmowanie wysokich dawek GEM, co wiąże się z występowaniem skutków ubocznych. Niestety, wiele typów nowotworów, w tym rak trzustki, rozwija oporność na GEM.

Flurbiprofen (FLU) jest dobrze znanym niesteroidowym lekiem przeciwzapalnym (NLPZ), którego mechanizm działania opiera się głównie na hamowaniu enzymów cyklooksygenazy (COX) zaangażowanych w syntezę prostaglandyn. Przeciwnowotworowe działanie NLPZ badano w różnych nowotworach, w tym okrężnicy, trzustki, wątroby, piersi, jajnika i tarczycy. Oprócz właściwości przeciwzapalnych, NLPZ wykazały cechy przeciwnowotworowe, takie jak zdolność do indukcji apoptozy, hamowania angiogenezy i wzmacniania komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Nadekspresja COX zaobserwowana została w różnych nowotworach (np. trzustki, piersi, płuc i okrężnicy), a nadekspresja COX stymuluje angiogenezę, która jest kluczowym czynnikiem w występowaniu przerzutów.

“Kombinacja GEM-FLU to nowatorski koniugat. Wpływ różnych NLPZ, w tym flurbiprofenu, na komórki raka trzustki (BxPC-3 i PANC-1) został dokładnie zbadany, ujawniając, że flurbiprofen wykazywał najsilniejsze działanie antyproliferacyjne i migracyjne na komórki raka trzustki” – podkreślają autorzy badania, uzasadniając wybór flurbiprofenu spośród dostępnych NLPZ.

Jakie wyzwania ujawnia in vitro współdziałanie GEM i FLU?

Podstawowym celem badania było zbadanie skuteczności GEM w połączeniu z FLU jako potencjalnego czynnika zwiększającego cytotoksyczne działanie GEM. W tym celu dokładnie zbadano apoptozę i nekrozę, a także ekspresję białek apoptotycznych w liniach komórkowych raka trzustki (PCC), w tym PANC-1, AsPC-1 i BxPC-3. Ponadto przetestowano przydatność mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (BM-MSC) poddanych działaniu GEM i FLU oraz pożywki kondycjonowanej znad tych komórek (CM) jako elementów wspierających działanie in vitro GEM i FLU.

Badania wykazały, że BM-MSC wyizolowane z ludzkiego szpiku kostnego wykazywały normalną morfologię, przyleganie do naczynia hodowlanego i zdolność do proliferacji in vitro. Analiza cytometryczna wykazała, że BM-MSC posiadały markery powierzchniowe CD73+, CD90+ i CD105+, ale nie wykazywały obecności markerów powierzchniowych CD11b-, CD19-, CD34-, CD45- lub HLA-DR-.

BM-MSC wykazywały niewielką wrażliwość na GEM w teście MTS. Zaobserwowano 10% spadek żywotności komórek przy najwyższym badanym stężeniu 100 μM GEM. Jednak wykazano statystycznie istotny wzrost toksyczności kombinacji GEM + FLU w porównaniu do samej GEM. Podobną tendencję zaobserwowano dla szerokiego zakresu stężeń GEM + FLU (10 nM–100 μM). Sam FLU nie wpływał znacząco na przeżywalność komórek w testach 24- lub 48-godzinnych.

Niezależnie od stężenia kombinacji GEM + FLU, żywotność komórek PCC PANC-1, AsPC-1 i BxPC-3 była niższa niż po zastosowaniu samej GEM. Różnice w przeżywalności badanych linii komórkowych po leczeniu GEM i GEM + FLU były widoczne już przy niskich dawkach GEM + FLU (10 nM + 10 nM) po 24 godzinach. Zwiększenie dawki FLU (1 mM i 2 mM) skutkowało znacznym spadkiem proliferacji ze statystycznie istotnym znaczeniem we wszystkich badanych liniach komórkowych.

W porównaniu do GEM, wartość IC₅₀ dla kombinacji GEM + FLU zarejestrowana dla linii komórkowej PANC-1 wahała się od 109,3 (±9,6) μM do 228,2 (±16,3) μM, podczas gdy dla BxPC-3 zakres wynosił od 1,9 (±0,5) μM do 98,6 (±8,8) μM, wskazując na wyjątkowo wysoką wrażliwość linii PANC-1 na dodanie FLU. Najwyższą oporność zaobserwowano dla BM-MSC.

Analiza cyklu komórkowego wykazała niejednorodny wpływ leków na poszczególne linie komórkowe. W przypadku linii PANC-1 i AsPC-1 zaobserwowano zatrzymanie podziału komórek w fazie G1, szczególnie po zastosowaniu kombinacji GEM + FLU (10 μM + 10 μM). Komórki w fazie sub-G1 zaobserwowano dla linii BxPC-3, szczególnie po leczeniu GEM + FLU (10 μM + 2 mM), co wskazuje na fragmentację DNA charakterystyczną dla komórek apoptotycznych. Wpływ badanych cząsteczek spowodował modyfikację morfologii komórek i wakuolizację PCC.

Komórki apoptotyczne w liniach komórkowych raka trzustki były statystycznie istotnie wyższe po leczeniu kombinacją GEM + FLU niż samą GEM, szczególnie przy wysokich dawkach FLU (2 mM). W przypadku linii PANC-1, AsPC-1 i BxPC-3 średni odsetek żywych komórek po 48 godzinach wynosił odpowiednio 46,4 (±0,1)%, 42,8 (±4,61)% i 40,5 (±5,78)% dla grup leczonych GEM + FLU (10 μM + 2 mM). BM-MSC charakteryzowały się wyższym odsetkiem (52,04 ± 0,58%) żywych komórek dla GEM + FLU (10 μM + 2 mM), jednak było to zbyt niskie, aby wykorzystać te komórki jako nośniki tych leków, dlatego powyższa kombinacja została wykluczona z dalszych badań.

Co mówią molekularne badania o synergii GEM i FLU?

Testowane pożywki kondycjonowane z BM-MSC traktowanych i nietraktowanych GEM i FLU (CM, CM-GEM i CM-GEM + FLU) były rozcieńczane 1:1 ze świeżą pożywką przed leczeniem PCC. Zaobserwowano spadek żywotności linii komórkowych raka trzustki po leczeniu CM-GEM i CM-GEM + FLU. Odsetek żywych komórek po 72 godzinach wynosił 23,5 (±2,6)% dla CM-GEM; 20 (±1,22)% dla CM-GEM + FLU dla PANC-1; 61,55 (±3,04)%; 50,4 (±2,96)% dla AsPC-123 oraz 25,66 (±3,9)%; i 23,00 (±2,06)% dla BxPC-3. Dodanie FLU nie wpłynęło znacząco na przeżywalność PANC-1 i BxPC-3. Z kolei leczenie CM promowało wzrost komórek nowotworowych AsPC-1.

Zaobserwowano znaczący wzrost odsetka komórek apoptotycznych i nekrotycznych po leczeniu PCC za pomocą CM-GEM i CM-GEM + FLU. Dla CM-GEM średni odsetek żywych komórek po 72 godzinach wynosił 84,27% dla PANC-1; 78,64% dla AsPC-1; i 65,05% dla BxPC-3, podczas gdy dla CM-GEM + FLU wynosił odpowiednio 80,83%, 77,63% i 64,16%. Nie zaobserwowano istotnego wpływu kombinacji GEM + FLU i pożywki kondycjonowanej z BM-MSC lub wpływu CM na odsetek żywych PCC.

Analiza ilościowa komórek PANC-1, AsPC-1 i BxPC-3 barwionych CFDA została przeprowadzona po 24-godzinnej współhodowli z nieleczonymi i leczonymi GEM (10 μM) lub GEM + FLU (10 μM + 10 μM) BM-MSC w stosunku 1:3 i 1:2 (BM-MSC:PCC). BM-MSC leczone GEM, zarówno samą, jak i w połączeniu z FLU, indukują efekt cytostatyczny na badane PCC. W szczególności efekt cytostatyczny był widoczny po dodaniu leczonych BM-MSC w stosunku 1:2. Z drugiej strony, nieleczone BM-MSC (stosowane w stosunku 1:2 i 1:3) stymulowały wzrost komórek nowotworowych. Dodanie FLU nie zwiększyło efektu GEM i nie stwierdzono istotnych różnic między próbkami GEM (10 μM) i GEM + FLU (10 μM + 10 μM).

Badania Western blot potwierdziły zwiększoną ekspresję kaspazy-3 i zmniejszenie p-Ser-GSK3β i PARP1 w komórkach nowotworowych trzustki po leczeniu kombinacją GEM + FLU. “Ekspresja kaspazy-3 znacząco wzrosła w linii PANC-1 po leczeniu GEM + FLU (10 µM + 2 mM), co wskazuje na intensywną aktywację procesu apoptotycznego” – zauważają badacze. Nie zaobserwowano zmian w PARP1 po 24 godzinach w porównaniu do kontroli, jednak po 48 godzinach był on niewykrywalny w przypadku najwyższej dawki leków (10 µM + 2 mM). Ekspresja p-Ser-GSK3β zmniejszyła się, szczególnie po zastosowaniu kombinacji GEM + FLU (10 µM + 2 mM), co wskazuje na aktywację GSK3β. Z kolei zmniejszona ekspresja FAS w kombinacji GEM + FLU (10 µM + 2 mM) może sugerować zmiany w sygnalizacji zależnej od receptorów śmierci komórkowej i blokowanie szlaku śmierci opartego na FAS.

Mimo niższych dawek stosowanych leków, kaspaza-3 była nadal wyraźnie wykrywalna po leczeniu komórek PANC-1 za pomocą CM-GEM i CM-GEM + FLU. Zaobserwowano również zwiększoną ekspresję PARP1 w porównaniu do kontroli i CM, jednak p-Ser-GSK3β był niewykrywalny w leczeniu CM-GEM i CM-GEM + FLU. Podobnie jak w przypadku leczenia pojedynczymi lekami, ekspresja FAS również zmniejszyła się po leczeniu CM-GEM + FLU.

Porównując odpowiedź na leczenie wybranych PCC kombinacją GEM + FLU, ujawniono różnice w aktywacji szlaków apoptozy w zależności od obecności i dawki FLU; dlatego obserwowane zjawiska mogą być związane z różną wrażliwością tych komórek na terapię. Praktycznie, po zastosowaniu kombinacji GEM + FLU zaobserwowano zwiększoną ekspresję białek odpowiedzialnych za inicjowanie szlaków apoptozy.

Apoptoza jest najbardziej intensywna przy dawce GEM + FLU (10 μM + 2 mM) dla linii PANC-1, co potwierdza silna aktywacja kaspazy-3 (jednego z kluczowych efektorów apoptozy) i degradacja PARP1. W rzeczywistości nie wykazano ekspresji FAS po podaniu kombinacji leków; jednak linie AsPC-1 i BxPC-3 reagują inaczej na leczenie związkami. W przypadku AsPC-1 odpowiedź apoptotyczna jest słabsza, a niektóre markery (takie jak kaspaza-3 i FAS) pozostają mniej aktywne, co może wskazywać na większą oporność linii komórkowej. Widoczna jest aktywacja apoptozy poprzez silną ekspresję kaspazy-3 i degradację PARP1 po 24 godzinach dodania FLU, podczas gdy nie wykazano ekspresji p-Ser-GSK3β (szlaki apoptotyczne mogą być różnie regulowane, niezależnie od GSK3β). Takie różnice w odpowiedzi na leczenie mogą wskazywać na specyficzne mechanizmy oporności, wpływające na skuteczność terapii dla różnych typów raka trzustki.

Z kolei analiza odpowiedzi PCC na działanie pożywki kondycjonowanej (CM), pożywki zawierającej metabolity gemcytabiny (CM-GEM) i metabolity gemcytabiny i flurbiprofenu (CM-GEM + FLU) ujawnia dalsze różnice w aktywacji apoptozy i zaangażowaniu szlaków sygnałowych. Efekt cytotoksyczny CM-GEM i CM-GEM + FLU jest najbardziej widoczny w linii BxPC-3. Spadek przeżywalności komórek BxPC-3 i aktywację kaspazy-3 odnotowano również po zastosowaniu samego CM; ponadto podobne wyniki odnotowano, gdy leki były stosowane samodzielnie w wyższych dawkach. W PANC-1 apoptoza jest słabsza po zastosowaniu CM, CM-GEM i CM-GEM + FLU, podczas gdy w linii AsPC-1 można zaobserwować większe zaangażowanie kaspazy-3 w porównaniu do leków stosowanych samodzielnie. Z drugiej strony szlak FAS jest silnie tłumiony w obecności flurbiprofenu, co może sugerować zaawansowany etap apoptozy (FAS ulega degradacji) lub zmniejszoną aktywność szlaku zależnego od FAS.

Ciekawe wyniki otrzymano w ekspresji p-Ser-GSK3, która znika w PANC-1 wraz ze wzrostem stężenia FLU (w porównaniu do leków stosowanych samodzielnie), sugerując aktywację GSK3β, co może skutkować powiązanym efektem na przeżywalność komórek. W linii komórkowej BxPC-3 ekspresja p-Ser-GSK3β pozostawała stabilna, gdy leki podawano samodzielnie. Natomiast po leczeniu CM-GEM/CM-GEM + FLU zaobserwowano wzrost fosforylacji i blokowanie funkcji GSK3β (co może towarzyszyć apoptozie). Należy podkreślić, że GSK-3β jest silnie ekspresjonowana w wielu nowotworach, będąc zaangażowaną w regulację proliferacji, apoptozy i chemooporności. Z drugiej strony, dotychczas raportowano różne role GSK-3β jako czynnika przeciwnowotworowego i promującego rozwój guza; dlatego stosowanie leków celujących w GSK-3β w leczeniu nowotworów wydaje się kontrowersyjne. Pomimo faktu, że rola GSK-3β w komórkach nowotworowych jako białka pro-onkogennego lub supresorowego jest dyskusyjna, uzgodniono, że GSK3-β jest białkiem pro-nowotworowym i dobrym kandydatem do ukierunkowanego leczenia nowotworów trzustki.

W badaniu wykazano, że GEM + FLU pośredniczy w apoptozie i hamowaniu proliferacji poprzez wpływ na kluczowe białka, takie jak kaspaza-3, PARP1, GSK3β i FAS. Jednak wiele białek zaangażowanych w te szlaki nie jest w pełni zrozumiałych. Jedną z możliwości walki z tym jest wykorzystanie sztucznej inteligencji. Modele AI, takie jak AlphaFold, są w stanie przewidzieć strukturę i domeny funkcjonalne kluczowych białek oraz ich interakcje z receptorami błonowymi w komórkach nowotworowych. Planuje się wykorzystanie modeli AI do przewidywania geometrii białko-ligand lub białko-białko, co może zapewnić głęboki wgląd w interakcje GEM i FLU. Udowodniona skuteczność modeli AI w podobnych badaniach daje możliwość wzbogacenia dalszych badań o informacje na temat potencjalnych mechanizmów interakcji GEM-FLU. W konsekwencji może to być pomocne w planowaniu i rozwijaniu spersonalizowanej strategii terapeutycznej.

Uzyskane wyniki sugerują, że kombinacja GEM z FLU może stanowić obiecującą strategię terapeutyczną nie tylko w raku trzustki, ale także w innych typach nowotworów. “Kombinacja flurbiprofenu i gemcytabiny może być uznana za potencjalnie skuteczną strategię w terapii raka trzustki, szczególnie w kontekście hamowania proliferacji i indukcji śmierci komórek nowotworowych” – konkludują autorzy.

Badanie ma jednak pewne ograniczenia. Eksperymenty in vitro, choć wartościowe do testowania nowych kombinacji leków, mają ograniczoną zdolność do dokładnego przewidywania skuteczności leku u pacjentów, nie mogą w pełni odtworzyć złożonego mikrośrodowiska guza i są podatne na zmiany komórkowe podczas hodowli. Dodatkowo, heterogeniczność BM-MSC może również stanowić wyzwanie. Podkreśla to potrzebę nowych strategii oczyszczania MSC dla przyszłej standaryzowanej produkcji i niezawodnego zastosowania klinicznego.

Przyszłe badania in vivo z wykorzystaniem odpowiednich modeli zwierzęcych będą niezbędne do walidacji wyników in vitro, optymalizacji strategii dawkowania, zmniejszenia potencjalnych skutków ubocznych i identyfikacji nieprzewidzianych odpowiedzi biologicznych na badaną kombinację leków. Niemniej jednak, przedstawione wyniki otwierają nowe możliwości w leczeniu jednego z najbardziej opornych na terapię nowotworów.

Podsumowanie

Badania koncentrują się na poszukiwaniu skutecznych metod leczenia raka trzustki, który charakteryzuje się wysoką śmiertelnością i niskim wskaźnikiem przeżycia 5-letniego. Naukowcy skupili się na wykorzystaniu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) jako potencjalnych nośników leków oraz zbadaniu skuteczności kombinacji gemcytabiny (GEM) z flurbiprofenem (FLU). MSC wykazują unikalne właściwości, w tym niską immunogenność i tropizm do miejsc zapalnych, co czyni je obiecującymi kandydatami do dostarczania leków. Badania in vitro wykazały, że kombinacja GEM-FLU skutecznie hamuje proliferację komórek nowotworowych i indukuje apoptozę, szczególnie w linii komórkowej PANC-1. Zaobserwowano również, że pożywka kondycjonowana z MSC traktowanych GEM i FLU wykazuje działanie przeciwnowotworowe. Analiza molekularna potwierdziła zwiększoną ekspresję białek związanych z apoptozą po zastosowaniu kombinacji leków. Mimo obiecujących wyników, konieczne są dalsze badania in vivo dla pełnej walidacji skuteczności tej strategii terapeutycznej.